1、课题来源与背景
    　　传统的疫苗制备是根据Pasteur的原理，一般用灭活的病原体或减毒病原体株接种宿主，获得对该病原体感染的免疫（抵抗）能力。近年来随着基因重组和分子生物学工程技术的发展，基因工程亚单位疫苗能够将病原体蛋白中有效成分在实验室大量制备和纯化，具有安全性好及高产量的特点。但筛选和确定有效抗原成分的前期工作量巨大，步骤繁琐。且不能针对非传染性疾病的预防与治疗。自然杀伤细胞（Natural Killer Cell，NK）是机体重要的具有自然杀伤活性的免疫细胞，对肿瘤细胞和病毒感染的细胞有自然杀伤效应。但其杀伤作用不强且是非特异的。特异性抗体作用靶细胞后也可介导NK细胞对靶细胞的杀伤作用（ADCC）。但ADCC的作用十分有限。MICA分子的表达增高能激活NK细胞分泌细胞因子和化学因子杀伤靶细胞。正常情况下由于表达量低不会激活NK细胞的杀伤效应。提高靶细胞的MICA表达，会导致NK细胞的非特异性杀伤。我们提出科学假说：将特异性抗体与NK细胞受体结合分子相结合制成一种分子疫苗，利用抗体的定向诱导作用实现NK细胞特异性靶向杀伤。新型分子疫苗的研发是当前应用基础研究的热点之一，具有重要的应用前景。
    　　2、研究目的与意义
    　　研究的目标：
    　　1） 单克隆抗体IgG分子生物学标记： 利用抗体与相应的抗原结合的特性，将激活NK细胞的NKG2D受体结合分子MICA定向分布于靶细胞膜的表面，然后诱导NK细胞与靶细胞进行接触，触发NK细胞的杀伤效应。抗体IgG可以是目前可获得任何能作用于靶细胞表面特殊标志的抗体。对抗体IgG分子的FC段进行多种生生物学标记，包括亲和素，FIAsH等。
    　　2） 重组蛋白质MICA分子(NKG2DL之一）的羧基端添加特殊的多肽链： 用于亲和素生物素连接将在MICA分子融合生物素化的12个氨基酸多肽链，或在MICA分子的羧基端廷申6个氨基酸的TC-Tag。
    　　3） 两种分子在实验室连接后制成具有靶向定位和触发NK细胞自然杀伤功能的分子疫苗。 MICA分子在靶细胞膜表面增多，即可触发NK细胞对靶细胞的杀伤效应。应用于靶向特异性抗感染免疫和抗肿瘤免疫的预防和治疗。
    　　研究的意义
    　　主要研究方向以特异性抗体IgG作为靶向定位分子，将能活化NK细胞的NKG2D受体激活分子(NKG2DL)之一，MICA分子通过生化连接致靶向定位分子IgG-FC端。两个分子整合形成分子疫苗，能选择性地将激活NK细胞的MICA分子标记到靶细胞的表面，从而调动自身机体自然杀伤细胞实现对病毒感染细胞，或肿瘤细胞的杀伤效应。把抗体与MICA分子连结起来形成大分子结构可以作为一种靶向诱导NK细胞杀伤的分子疫苗，用于传染病和非传染病的预防和治疗。其中特异性靶向单克隆抗体(IgG)分子与MICA分子的结合方式是本课题研究的攻关难点。我们将建立一套测试NK细胞杀伤的细胞模型，用于对不同的生化连接机制与效应的免疫学分析方法。筛选出一种适合于多种单克隆抗体和生物效应最佳的分子连接方法。这种靶向诱导NK细胞自然杀伤性的分子疫苗适用于对传染病与非传染病的预防与治疗。我省人口密集，常见传染病发病人数居高不下。非传染性疾病如肿瘤发病率有逐年增高的趋势。新型分子疫苗的研究作为我省发展中解决重大疾病的预防与治疗的关键性问题具有重要的意义。本基础应用研究具有起点高和研究周期短的特点。具备参与国家层面重大基础研究的竞争力。
    　　3、研究的内容：
    　　1）FIASH标记抗体在体外实现与NK细胞激活分子MICA-TC-Tag对接，观察结合的效应(出现荧光反应信号)。
    　　2）对五种不同的特异性抗体的靶向定位特性分别进行测试，靶细胞包括病毒感染的细胞，肿瘤细胞和细胞株等选择亲和力的靶向结合的抗体进行生物学标记。
    　　3）NK细胞株的培养和体外结合MICA分子的克隆筛选，
    　　4）人体外周血NK细胞的分离与培养。NK细胞NKG2D受体分布与杀伤效应的分析。
    　　5）重组NK细胞激活型受体结合分子MICA与TC-Tag融合蛋白质的制备，拟应用基因工程技术和昆虫细胞杆状病毒蛋白质表达可系统制备可溶性重组蛋白质，从细胞培养的上清液提取和纯化该蛋白质分子。
    　　6）体外靶向定位NK杀伤效果的测试备选方案。
    　　4、创见与创新
    　　创新点： 首次将抗体的靶向特异性与NK细胞自然杀伤活性结合起来，利用NKG2D-MICA触发NK细胞杀伤效应，实现对靶细胞特异性攻击与清除。
    　　5、取得的成果
    　　我们构建了由NKG2D配体MICA的细胞外结构域和抗CD20 scFv组成的融合蛋白。 这种融合可以结合NK细胞和CD20 +肿瘤细胞。通过进一步的实验表明，该蛋白可以特异性诱导NK细胞裂解CD20 +白血病细胞。我们证明重组蛋白质特异性靶向NK细胞以溶解白血病细胞的表达可能导致开发治疗白血病的新策略。
    　　

成果完成人：邹义洲;王勇;王芙艳;王洁;罗奇志;胡娟;罗伟光;郭靖;郭旭丽

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