既往有报道黄连素有抗菌作用，但黄连素抑制多药耐药肺炎克雷伯菌的耐药性及其具体的耐药机制尚未见报道。
     1.本研究体外环丙沙星逐步浓度梯度法及耐药稳定性传代试验诱导筛选出对氟喹诺酮高度耐药并稳定的KPn菌株，构建多药耐药的KPn菌株模型（对环丙沙星的MIC均超过128μg/ml，同时对莫西沙星（MXF）的耐药率为100%）。这是我们课题组独有的技术方法并在国内外领先。
     2.我们应用分光光度计测定细菌的OD600值。以培养时间为X轴，OD600值为Y轴，取平均值绘制出不同菌株的生长曲线。比较了单用黄连素、单用环丙沙星、不同浓度的黄连素+环丙沙星作用下KPn菌株的生长曲线，探讨了单用黄连素、单用环丙沙星、不同浓度的黄连素+环丙沙星对KPn生长的影响。我们比较了黄连素和环丙沙星两药单用及联用时最低抑菌浓度（MIC）并通过微量棋盘稀释法，计算总合部分抑菌浓度（ΣFIC），分析两种抗菌药物的体外相互作用。结果显示两药联用与单用环丙沙星或黄连素相比，MIC下降超过1/2 MIC，两药联用起相加作用有77.27%（17 /22），起协同作用有18.18%（4 / 22）。 两药联用组使KPn细菌量下降1.51-4.17 log10 CFU/ml，与单用环丙沙星相比，细菌量下降 2.41-5.7log10 CFU/ml，单用黄连素1024μg/ml与单用环丙沙星相比，细菌量下降0.9-1.79 log10 CFU/ml。研究结果发现：环丙沙星与黄连素联用能有效抑制多药耐药肺炎克雷伯菌的生长，能减少环丙沙星的用量、增加其抗菌活性与降低耐药性的产生。环丙沙星联用前后用量下降>1/2而<3/4，黄连素联用前后用量下降≥1/2。这些研究结果对临床抗感染治疗有很大的意义，为国内外首次报道。
     3.本研究对黄连素抑制KPn多药耐药分子机制进行了深入的探讨，应用荧光定量PCR（RT-PCR）测定和比较环丙沙星、黄连素单用组及两药联用组在AcrAB-TolC基因转录表达水平的差异，发现黄连素和环丙沙星两药联用组与空白对照组相比，acrA、acrB和tolC基因表达明显上升，大于14倍（P＜0.05），单用黄连素组与空白对照组相比，acrA、acrB和tolC基因表达也上调4倍（ P＜0.05）。单用环丙沙星组与空白对照组相比，acrA、acrB和tolC基因表达无明显差异 （P＞0.05）。研究结果显示：两药联用在一定程度上能有效抑制多药耐药肺炎克雷伯菌的生长，其中的原因是使KPn耐药外排泵系统作用翻转，AcrAB-TolC转录表达升高导致能量耗竭，使KPn的生长受到抑制甚至死亡。为国内外首次报道。
     4.本研究发现：黄连素与喹诺酮类抗菌药物联用时的最佳浓度为500ug/ml，这时黄连素使环丙沙星的抗菌作用增加了3.4倍，该浓度下的体外联合抗菌效果最佳。根据公式剂量D=V*K*τ*C/F，计算出人体内黄连素的剂量为0.43g，临床上的应用为0.43g q8h。此剂量在人体使用的安全范围内，适用于临床抗菌治疗。这一研究结果是国内外首次报道黄连素联用环丙沙星治疗临床感染的药物剂量，对临床抗感染治疗有重大的临床实际意义。
    本研究结果有助于挖掘黄连素的抗菌和抑制细菌耐药性作用，并制订联用黄连素的优化抗菌治疗用药方案，提高临床疗效，同时为抗菌新药的研制提供理论和实验依据。我们近期在感染病科针对下呼吸道感染的患者尝试应用环丙沙星与黄连素联用（目的是减少碳青霉烯类抗生素的应用）进行治疗，发现效果良好，退热时间缩短较平均时间1天左右，住院时间也相应缩短1-2天。
     5.多次在医院内举办和其他医院进行细菌感染现状与抗生素合理应用及医院感染控制知识的专题讲座，提高医务人员对医院感染危害的认识，受到相关医院的好评；课题组成员因此经常应邀参加疑难危重感染如败血症等会诊和救治，为医院相关科室和外院相关问题的诊治作出贡献而受到好评。
     6.通过本课题的研究，对科室的人才建设作出了贡献，并培养了3名硕士研究生。通过本项目培养3名硕士研究生。

成果完成人：叶晓光;周晓元;张宿荣;何桌珊;苏杞敏;何丽婷;王若论

完成单位：广州医科大学附属第二医院

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